Ученые БФУ имени Иммануила Канта с коллегами из СПбГУ и ИФР имени К.А. Тимирязева РАН описали ключевые условия для проведения успешного биохимического анализа методом газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией. Этот подход широко используется для определения химического состава растений. Поэтому собранная авторами в обзоре информация поможет усовершенствовать этот метод и лучше понять, какие вещества синтезируют клетки растений в разных условиях. Результаты исследования опубликованы в журнале Plants.
В зависимости от условий окружающей среды (влажности, освещения, действия различных факторов стресса) растения синтезируют разное количество низкомолекулярных веществ (метаболитов) — простых сахаров, аминокислот, органических кислот и других. Эти соединения влияют на обмен веществ растений и вовлечены в их адаптацию к изменениям окружающей среды. Они также служат строительным материалом для сложных биологических полимеров и вступают в пути биосинтеза разнообразных вторичных соединений, которые определяют лекарственную ценность растений. В связи с этим биологи изучают химический состав разных видов растений в разных условиях.
Для этого часто используют газовую хроматографию с масс-спектрометрией. Это подход, который позволяет выявить до нескольких сотен соединений в одном образце — растительном экстракте. Однако из-за того, что метаболиты сильно отличаются по химическим и физическим свойствам и по содержанию в образцах, для увеличения эффективности этого метода ученым необходимо усовершенствовать способы подготовки образцов к газовой хроматографии с масс-спектрометрией.
Исследователи из Балтийского федерального университета имени Иммануила Канта (Калининград) с коллегами из Санкт-Петербургского государственного университета (Санкт-Петербург) и Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН (Москва) детально рассмотрели все этапы этого процесса — от измельчения собранных растений до расшифровки полученных первичных инструментальных данных.
Для успешного анализа в первую очередь важно правильно подготовить образец. Растительный материал сразу после сбора лучше всего заморозить в жидком азоте. Такая процедура позволяет остановить химические превращения в клетках и «запечатлеть» реальный состав метаболитов в них. Однако есть и другие методики, не требующие замораживания и хранения образцов в замороженном состоянии. Они включают, например, предварительную сушку образцов, обработку ультразвуком или микроволновым излучением.
Во время экстракции (то есть выделения метаболитов из клеток) важно поддерживать оптимальную температуру и использовать растворители, лучше всего взаимодействующие с целевыми веществами. Поскольку в растениях содержатся разнообразные по химическим свойствам вещества, лучших результатов часто удается добиться при многоэтапной экстракции. В этом случае образцы последовательно помещают в несколько разных растворителей, которые наиболее эффективно извлекают те или иные группы соединений.
«Важно учитывать, что многие вещества, содержащиеся в растениях, не летучи, из-за чего напрямую с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрией достоверно оценить их количество в растении не удастся. Поэтому исследователям приходится прибегать к дополнительному этапу подготовки образцов — дериватизации. Это химическая модификация нелетучих соединений, которая превращает их в форму, пригодную для анализа», — поясняет Акиф Маилов, научный сотрудник Лаборатории биоаналитической химии Высшей школы живых систем БФУ имени Иммануила Канта.
Кроме того, авторы подчеркнули важность правильной обработки и интерпретации полученных данных. Так, из них необходимо убирать «шумы» (случайные сигналы), а также выполнять калибровку — сравнение с эталонными данными о содержании тех или иных веществ в растворе.
Таким образом, четко следуя оптимальным протоколам, специалисты могут с помощью газовой хроматографии с масс-спектрометрией определить содержание нескольких сотен растительных метаболитов и найти среди них ценные.
«Мы собрали и обобщили информацию о способах подготовки и анализа растительных экстрактов методом газовой хроматографии, сопряженной с масс-спектрометрией в онлайн-режиме. В дальнейшем мы планируем проверить целый ряд протоколов, основанных на этом методе, в нашей лаборатории. В частности, в ближайшее время планируется запустить анализ жирнокислотного состава растений», — подводит итог Андрей Фролов, доктор биологических наук, профессор, руководитель Лаборатории аналитической биохимии и биотехнологии Института физиологии растений имени К.А. Тимирязева РАН.
Подписывайтесь на InScience.News в социальных сетях: ВКонтакте, Telegram, Одноклассники.
