Ученые Томского политехнического университета вместе коллегами из университетов Чехии предложили новый подход к определению активности ферментов. Созданный плазмонно-активный оптоволоконный сенсор позволяет проводить процедуру быстро и с минимальным нарушением ферментативной системы. Разработка открывает перспективы к определению критично важного параметра многих технологических процессов — активности ферментов — непосредственно в биохимических реакторах или в суспензии тканей, микроорганизмов. Исследование опубликовано в Sensors and Actuators B: Chemical, сообщила пресс-служба Томского политехнического университета.
Ферменты, являясь естественными биологическими катализаторами, могут значительно ускорять химические реакции. Помимо их чрезвычайно важной биологической функции в живых организмах, ферменты активно используются в различных технологических процессах. Например, они нашли широкое применение в биохимических реакторах в качестве катализаторов для широкого спектра процессов, включая изготовление пищевых продуктов и добавок, модификацию антибиотиков, создание различных датчиков и аналитических приборов, а также для производства различных чистящих средств.
Для таких целей обычно используются различные простые источники ферментов, но большинство «коммерческих» ферментов извлекаются из бактерий или растений. При этом активность ферментов, особенно выделенных из микроорганизмов, может существенно различаться в зависимости от источника, особенностей развития микроорганизмов и окружающих условий. Кроме того, активность ферментов может снижаться в процессе их использования из-за постепенной деградации. Поэтому активность ферментов необходимо тщательно контролировать как сразу после их производства, так и в процессе использования.
По словам ученых, обычные методы измерения ферментативной активности всегда требуют отбора образца и его очистки для проведения дальнейшего анализа. Таким образом, практически невозможно оценить активность фермента in situ, например, непосредственно в реакторе или в суспензии ткани или микроорганизмов.
Актуальной остается разработка методов экспрессного и наименее инвазивного определения ферментативной активности. В этой работе ученые предлагают использовать для локальной, простой экспресс-оценки активности фермента биохимический сенсор, созданный на основе плазмон-активного оптоволоконного зонда.
Образцы зонда были изготовлены из многодомовых оптических волокон на основе кварцевого стекла, на поверхность которых методом плазменного напыления было нанесено покрытие из тонких полосок золота. Исследователи поясняют, что золото среди других распространенных плазмонно-активных металлов было выбрано потому, что оно является наиболее химически стабильным и имеет пик плазмонного резонанса в удобной спектральной области.
В качестве модельной реакции химики выбрали оценку активности β-глюкозидазы. Этот фермент встречается в клетках почти всех живых организмов и выполняет множество разнообразных функций, например, участвует в деградации биомассы, антибактериальной защите организма, клеточном биосинтезе и так далее.
«Ключевым моментом в исследовании является придание сенсору чувствительности только к одному определенному ферменту, в нашем случае, β-глюкозидазе. Этого возможно добиться путем селективной модификации поверхности зонда β-глюкозидами — специфичными субстратами для этого фермента. Функционализация поверхности при помощи нового ключевого реагента — соли диарилиодония, содержащей β-фенил глюкозид и электроноакцепторный лиганд, привела к селективному введению β-глюкозидов, что и придало сенсору такую высокую чувствительность и селективность по отношению к ферменту», — отметила соавтор статьи, заведующая лабораторией «Химическая инженерии и молекулярный дизайн» Томского политехнического университета Елена Степанова.
Затем полученные образцы погружали в раствор фермента, состоящий из миндальной β-глюкозидазы и ацетата натрия, и непрерывно измеряли изменения спектров поглощения в видимой и ближней инфракрасной областях. Активность фермента определялась в разных температурных условиях — от 20 до 80 °C и использованием различных растворов.
«Ферментативное расщепление O-гликозидной связи, выбранное в качестве модельной реакции, приводит к высвобождению глюкозы, сопровождающемуся локальными изменениями химического окружения волоконного зонда. В результате возникает красное смещение полосы поглощения плазмона, величина которого пропорциональна скорости расщепления O-гликозидной связи, то есть активности фермента. Смещение полосы поглощения плазмона контролируется в отраженном свете после погружения волокон в соответствующую среду, что делает процедуру детекции предельно простой и позволяет проводить ее в экспресс-формате», — пояснила ученый.
Проведенные эксперименты показали, что предлагаемый научным коллективом подход позволяет просто и быстро определить активность β-глюкозидазы. Более того, процедура может быть выполнена in situ, с минимальным искажением ферментативной каталитической или биохимической системы.
«Мы продемонстрировали преимущества данного подхода на простой биохимической системе (фермент β-глюкозидаза и гликозидный субстрат), но аналогичная концепция может быть расширена на ряд альтернативных ферментов и соответствующих субстратов путем прививки различных субстратов к плазмон-активным оптоволокнам и их ферментативного расщепления, регистрируемого по сдвигу полосы поглощения плазмона в отраженном свете. Таким образом сенсор, в перспективе, может применяться для in situ мониторинга активности ферментов в биохимических реакторах или в живых тканях. Кроме того, он может быть использован для оценки активности бактерий в условиях окружающей среды, например, при мониторинге почвы или воды», – подытожила Елена Степанова.
Подписывайтесь на InScience.News в социальных сетях: ВКонтакте, Telegram, Одноклассники.
